中国生物制品学杂志投稿论文范文

发布时间：2013-12-05 15:42所属分类：医学校验论文浏览：1次加入收藏

氨基酸是生命的基石，是人体基本营养物质，也是蛋白质的组成单位。生命的产生、存在和消亡，均与蛋白质有关，而氨基酸是蛋白质的基本单位，如果人体缺乏氨基酸，就会导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，导致疾

　　氨基酸是生命的基石，是人体基本营养物质，也是蛋白质的组成单位。生命的产生、存在和消亡，均与蛋白质有关，而氨基酸是蛋白质的基本单位，如果人体缺乏氨基酸，就会导致生理功能异常，影响机体代谢的正常进行，导致疾病。检测复杂样本中氨基酸的含量对临床和科研等都具有重要意义。

　　摘要：建立了以12种同位素标记氨基酸做内标，采用衍生化方法，LC-MS/MS采用MRM方式同时定量30种氨基酸的检测方法。生物样本加入含有同位素内标的甲醇溶液，沉淀蛋白后氮气吹干加入衍生试剂，样本氨基酸与同位素氨基酸内标同步衍生，减小实验误差。选用TC-C18色谱柱，以水-乙腈（均含有0.01%七氟丁酸和0.1%甲酸）为流动相，采用梯度洗脱进行分离，30种氨基酸及其中的同分异构体都能基线分离。选用3200QTRAP型质谱仪的多重反应监测（MRM）扫描方式进行检测。本方法用于实时监测恶性血液病患者血浆氨基酸谱的变化，可以直接反映机体的代谢及营养状况，对患者的移植成功率及改善移植后患者的生存质量均有重要意义。

　　关键词：高效液相色谱-串联质谱,氨基酸,高通量定量,同位素内标,恶性血液病

　　1引言

　　目前，氨基酸检测技术繁多，1958年Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸[1]，实现了氨基酸分析的自动化[2]。其后，新的氨基酸分析方法不断涌现，柱前衍生反相高效液相色谱法[3～5]、毛细管电泳法[6]、质谱法等相继应用于氨基酸分析[2，7～14]。液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）充分整合了液相色谱对复杂样本的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度等优势，在生物体内源性小分子定性与定量方面有广泛应用，LC-MS/MS用于体内外氨基酸的检测在一定程度上解决了复杂基质干扰问题，极大地提高了检测水平和检测灵敏度，并实现了高通量检测。

　　在文献[9～13]基础上，结合前期氨基酸定量检测工作经验[14]，本实验探索了同位素内标和衍生化技术准确定量分析氨基酸的方法，采用12种稳定同位素氨基酸为内标，样本用盐酸正丁醇衍生化，经柱分离后进行LC-MS/MS定量检测，准确度比新生儿遗传代谢病LC-MS/MS筛查方法[9]有很大提高，且实验原理简单明确，样本前处理快速，实验数据准确可靠，可为临床、科研等提供准确的氨基酸参考数据。应用本方法对恶性血液病造血干细胞微移植患者和正常人群的血浆氨基酸进行了测定，为临床恶性血液病患者的营养监测和合理营养支持提供了理论依据。

　　2.5定量及数据处理

　　样本处理后经LC-MS/MS平台上特定的采集方法运行，得到总离子流图（图1），提取30种氨基酸对应的样本和内标的MRM离子流图，进行积分处理。每5μL进样中，含有12.5pmol从日常工作液中带入的精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸同位素内标衍生物，62.5pmol甘氨酸同位素内标衍生物，没有同位素内标的18种氨基酸采用色谱峰比较邻近的同位素进行定量分析，以特定的校正系数进行校准。通过对比50个样本使用本研究方法直接测定的氨基酸结果与稳定同位素iTRAQ标记LC-MS/MS方法[14]测定结果，产生每个氨基酸对应的特定校准系数K。

　　3结果与讨论

　　3.130种氨基酸高通量检测样本方法

　　方法的准确性和重复性是通过特定的质控样本来评价的，准备并分装多份质控样本，采用稳定同位素iTRAQ标记LC-MS/MS方法3次测定结果作为理论值，以实际测试中不同批次质控样本的相对误差（RE）和相对标准偏差（RSD）来评价方法的准确性和重复性。经多批次20个质控样本分析结果显示：30种氨基酸最低定量限均大于0.5μmol/L，30种氨基酸RE均小于15%，除半胱氨酸（RSD=32%）、肌氨酸（RSD=28%）外，其余氨基酸RSD均小于20%，考虑体内外样本氨基酸检测的复杂性和难度，综合认为本研究所建立的方法可用于体内外氨基酸的准确定量。

　　在本梯度条件下，采用高保留色谱柱进行分离，在15min可以同时检测44种离子对，涉及30种氨基酸及对应的12种同位素内标，同分异构体（肌氨酸、丙氨酸，γ-氨基丁酸、α-氨基正丁酸，亮氨酸、异亮氨酸，1-甲组氨酸、3-甲组氨酸等）均能够基线分离，见图2。

　　3.3LC-MS/MS氨基酸检测方法讨论

　　采用0.01%七氟丁酸-0.1%甲酸的乙腈-水为流动相，若仅采用乙腈-水作为流动相，氨基酸的峰形会有拖尾、宽峰等现象。加入0.01%七氟丁酸可以促进氨基酸在色谱柱上的保留，改善峰形。但当七氟丁酸含量升高时会抑制质谱信号，七氟丁酸尤其对质谱的负离子扫描有影响，所以用量一定要合适。而加入甲酸可以提供质子，增强正离子化信号，并提高氨基酸色谱峰信噪比，降低定量限，样本中可以达到很好的定量分析效果。实验过程中为解决出峰过宽的问题，适当提高有机相比例，既改善了峰形，又缩短了出峰时间。本实验采用的是高水相的C18色谱柱，此色谱柱在温度较高时保留会更好，综合多方面因素，采用了时间15min，柱温50℃的梯度洗脱模式。

　　氨基酸和氨基酸衍生物分子量均较小，应选用较小的离子喷射电压，但由于流速为800μL/min，离子喷射电压不宜太低，经过优化调试发现离子喷射电压在5500V时信号较高且稳定。而离子化温度低于500℃时，离子化程度不充分，影响氨基酸检测响应值和定量结果，当离子化温度过高（>650℃），又会造成离子化过程中部分中性基质碳化或焦化，污染离子源，降至580℃后离子化效果较好且不易焦化。气帘气选用140kPa，气帘气过小容易污染使中性分子和污染物进入质谱，造成基线过高而影响准确度。

　　本实验样本需要衍生处理，但衍生处理原理和操作均较简单。用正丁醇的羟基在HCl存在的环境下与氨基酸的羧基发生酯化反应，生成氨基酸衍生物，提高分子量并将氨基酸碎片离子从低分辨率的背景中脱离出来，提高检测的灵敏度，降低检测难度。实验条件较易控制，若样本批量较大时，可以采用96孔板处理，提高工作效率。由于采用了同位素内标，内标氨基酸与样本中需要检测的氨基酸进行平行同步处理，所以色谱行为、质谱的离子化效率和基质效应均能完全一致，避免了系统误差。

　　3.4恶性血液病患者血浆氨基酸谱的变化

　　本实验建立了一种高灵敏度和准确性的30种氨基酸LC-MS/MS定量方法，同分异构体基本都能基线分离，方法操作简单、快速、高通量，可成功用于临床诊疗和科研样本的检测。动态监测恶性血液病患者的血浆氨基酸在微移植治疗过程中的变化，能够反映某些营养素的缺乏，为进一步营养支持提供更有针对性和科学性的依据。

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