临床医学论文发表范文赏析

发布时间：2013-12-04 15:46所属分类：医学校验论文浏览：1次加入收藏

实体肿瘤的生长依赖于肿瘤新生血管的形成。多个研究表明，内皮前体细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)在肿瘤血管新生中起重要作用[1~4]。 【摘要】目的内皮前体细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是实体肿瘤血管新生及肿瘤生长的重要参与细胞，而

　　实体肿瘤的生长依赖于肿瘤新生血管的形成。多个研究表明，内皮前体细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)在肿瘤血管新生中起重要作用[1~4]。

　　【摘要】目的内皮前体细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是实体肿瘤血管新生及肿瘤生长的重要参与细胞，而手术有动员EPCs作用。本研究观察手术对EPCs数量及肿瘤生长的影响。方法Wistar大鼠行腋窝皮下接种Walker256肉瘤细胞。手术前和手术后14天，测量荷瘤鼠肿瘤大小，流式细胞术分析外周血EPCs数量及ELISA检测血清中血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)水平。结果Wistar大鼠在接种Walker256细胞后，按肿瘤大小分组发现，肿瘤生长较快组CD34+细胞数量增加明显(P0.05)，KDR+、CD34+KDR+细胞数量虽有增加但不明显。手术后，KDR+、CD34+KDR+细胞数量增加(P0.05)，但肿瘤大小无明显差异。此外，未观察到VEGF在肿瘤的生长及手术动员EPCs中的变化。结论干细胞与肿瘤生长有一定相关性。手术能动员EPCs，但在术后短期内，所动员的EPCs对肿瘤生长影响不明显，长期影响有待进一步研究。

　　【关键词】血管内皮前体细胞,血管内皮生长因子,实体肿瘤,手术

　　增加EPCs在血循环中的水平，能加速肿瘤的生长。多种因素影响血循环中EPCs数量，如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)参与造血干细胞和EPCs的动员与募集等过程[6,7]，而且，最近研究发现，手术能动员EPCs进入外周血循环中，但手术对肿瘤生长的影响研究较少。本研究选用Wistar大鼠接种Walker256肉瘤细胞后,测定荷瘤大鼠肿瘤生长情况，给予不同手术后，检测各组肿瘤大小、外周血EPCs数量及血清中VEGF水平。探讨手术动员EPCs的效果，以及这种效果对肿瘤生长的影响。

　　1材料与方法

　　1.1试剂RPMI1640培养液、胎牛血清和青霉素-链霉素双抗购自德国PAA公司，生物素化抗大鼠CD34单克隆抗体购自美国R&Dsystems公司，兔抗大鼠VEGF受体2(VEGFR2，亦称KDR)单克隆抗体购自美国Abcam公司，APC标记的抗生物素蛋白链菌素和FITC标记的羊抗兔Ig购自美国BDpharmingen公司，7-AAD购自美国Sigma公司。

　　1.2Walker256细胞培养Walker256细胞(中国科学院上海细胞所)于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI1640完全培养液，37℃，5%CO2，100%湿度，25mm2培养瓶内培养。贴壁长满至瓶底80%时传代。取对数生长期的细胞进行实验。

　　1.3实验动物Wistar雄性大鼠，体质量(200±20)g，由中国科学院上海动物实验中心提供，合格证号为SYXK(沪)2009-0082。Walker256细胞经大鼠腹腔体内传代，形成稳定的移植瘤模型，体内第3代移植瘤为瘤种。取瘤种的腹腔积液接种于大鼠腋窝皮下，每只动物接种0.4ml，进行大鼠荷瘤造模。造模第6天后，选瘤块直径1.0cm左右的荷瘤模型大鼠，共30只。

　　1.4动物实验荷瘤模型大鼠随机分为对照组10只、小手术组10只和大手术组10只。分组后对照组单纯麻醉;小手术组麻醉后腹部表皮切开1.0cm并缝合;大手术组麻醉后摘除一侧睾丸。苏醒后按常规饲养。手术第0和14天，分别测量各组动物的体质量、肿瘤体积，并尾静脉采集外周抗凝血(BD公司，EDTA抗凝)。

　　1.5外周血白细胞计数和分类制备细胞分布均匀的血涂片，待干，瑞氏染色后，油镜视野下计数100个白细胞，按其形态特征进行分类计数，获得单个核细胞占白细胞总数的比值。用计数板计数外周血每毫升中的白细胞数量，获得每毫升外周血中单个核细胞的绝对数量。

　　1.6抗体标记将大鼠外周EDTA抗凝血移至离心管，700g4℃离心20min，各样本的血浆分别收集至另一appendof管中，-20℃冻存备用。细胞沉淀重悬至2ml含0.5%(w/v)BSA及1.5mMEDTA的冷的PBS中，700g4℃离心20min，然后弃上清，细胞沉淀再重悬至1ml含0.5%(w/v)BSA及1.5mMEDTA的冷的PBS中，先用生物素化抗大鼠CD34单克隆抗体进行CD34标记，4℃孵育40min，PBS洗1遍后再加入CD34二抗及KDR抗体(预先将一抗与二抗混匀孵育)，4℃孵育40min。CD34和KDR标记的同时均做同型对照。红细胞裂解后，加入7-AAD(终浓度为1μg/ml)，室温孵育15min。

　　1.7流式细胞术检测FACSCalibur(美国BD公司)的发射激光由氩离子激光器产生，功率为15mW，激发光波长为488nm。FITC和APC荧光分别设在FL-1或FL-4荧光通道上，测定前用校准荧光微球校正仪器，每测定管收集100000个细胞，采用CellQuest软件进行结果分析。

　　1.8外周血EPC绝对数量计算根据外周每毫升血中单个核细胞绝对数，以及流式分析获得的外周血CD34+、KDR+及CD34+KDR+细胞在单个核细胞中的比值，分别计算出外周每毫升血中CD34+、KDR+和CD34+KDR+细胞绝对数。

　　1.9ELISA法检测VEGF含量取收集的血清，按试剂盒说明书(上海明睿生物技术有限公司)进行VEGF含量检测。先按说明书配制标准品共8个浓度，然后向反应孔加入标本或不同浓度的标准品，同时设空白孔，均设复孔。36℃孵育90min后，洗板5次;再加生物素化抗体VEGF，36℃孵育60min后，洗板5次;然后加酶结合底物，36℃避光孵育30min，洗板5次;然后加显色底物，36℃避光孵育15min后，中止反应。混匀后，用酶标仪(CK-21，Thermo，美国)测量OD值，波长为450nM。

　　1.10统计方法使用SPSS11.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，组间比较用单因素方差分析。

　　2结果

　　2.1荷瘤大鼠外周血EPCs数量对肿瘤生长的影响CD34和KDR是EPCs的重要膜表面标志，EPCs早期表达CD34，晚期表达KDR。在荷瘤大鼠中，按肿瘤体积大小将动物分成两组，发现与肿瘤体积较小组相比，肿瘤体积较大组的CD34+细胞数量增多(P=0.027)，KDR+、CD34+KDR+细胞数量增多，但差异无显着性。VEGF是血管新生的重要细胞因子，但本实验中，虽然大肿瘤组与小肿瘤组相比，外周血VEGF含量升高，但该差异无显着性(见表1)。表1荷瘤大鼠外周血EPC数量对肿瘤生长的影响

　　2.2手术对荷瘤大鼠肿瘤生长的影响手术后，与对照组相比，小手术组和大手术组的肿瘤体积没有明显变化(见表2)。表2手术对荷瘤大鼠肿瘤生长的影响

　　2.3手术对荷瘤大鼠外周血EPC数量的影响手术后，与对照组相比，大手术组的KDR+细胞和CD34+KDR+细胞的数量有明显增加(P0.05)，且大手术组的KDR+细胞比小手术组明显增加(P0.05);大手术组的CD34+细胞的数量有增加，但差异无显着性(见表3)。表3手术对荷瘤大鼠外周血EPC数量的影响

　　2.4手术对荷瘤大鼠外周血VEGF含量的影响荷瘤大鼠外周血中含有少量的VEGF，随着荷瘤时间的延长，外周血中VEGF含量都有明显增高(P0.01)。手术后14天，检测各组荷瘤大鼠外周血中VEGF的含量，结果表明手术对其没有影响(见表4)。表2手术对荷瘤大鼠外周血VEGF含量的影响

　　3讨论

　　本研究选用Wistar大鼠接种Walker256肉瘤细胞后,测定载瘤大鼠肿瘤生长情况，给予手术后，检测不同组别肿瘤大小、EPCs数量及VEGF水平，结果发现：Wister大鼠在接种Walker256细胞后，按肿瘤大小分组发现，肿瘤生长较快组CD34+细胞数量增加明显，KDR+、CD34+KDR+细胞数量虽有增加但不明显。手术后，KDR+、CD34+KDR+细胞数量增加，但肿瘤大小无明显改变。另外，未观察到VEGF在肿瘤的生长及手术动员EPCs中的变化。本研究结果表明，EPCs可能参与肿瘤生长，手术能动员EPCs，但在术后短期内，所动员的EPCs对肿瘤生长影响不明显，长期影响有待进一步研究。新血管形成在肿瘤的发生、发展和转移中占有重要地位，早期研究就已发现实体肿瘤在生长到直径超过1~2mm以后，需要通过形成新血管才能得以生存。EPCs是1997年Asahara等首次发现的，在体内能参与新血管生成的前体细胞，其表面特征性地表达CD34、血管内皮生长因子受体2(vascularendothelialgrowthfactorVEGFreceptor2，VEGFR2，又称KDR)，在早期主要表达CD34，在晚期主要表达KDR[10,11]。肿瘤组织可分泌一些因子刺激骨髓增加EPCs的生成，同时分泌因子动员生成的EPCs入外周血，募集其到肿瘤局部，使之在肿瘤局部富集并参与新的血管形成[1,2]。本研究将Walker256肉瘤细胞种于wistar大鼠腋窝皮下，发现肿瘤生长较快的大鼠外周血中CD34+细胞数量明显增加，这提示早期阶段的EPCs可能与肿瘤生长有关。多种因素动员EPCs到血循环参与血管新生。其中细胞因子是常见的动员因素，如诱导动员红细胞或白细胞入血的粒-单集落刺激因子(GM-CSF)和粒集落刺激因子(G-CSF)，能影响EPCs的动员;VEGF能上调SDF-1和SDF-1受体，SDF-1是EPCs趋化因子，能招募EPCs移向血管新生部位[12,13]。最近研究发现，手术能动员EPCs入血。Coden等发现实验小鼠开腹手术48h后，与麻醉对照组比较，血循环中EPCs数量增加10余倍，VEGF增加7倍[14]。我们将荷瘤的大鼠进行手术，结果发现，与对照组相比，大手术组的大鼠外周血中的KDR+细胞和CD34+KDR+细胞的数量有明显增加(P=0.004和P=0.04)，而且，与小手术组相比，大手术组的KDR+细胞数量增加更明显，而CD34+细胞的数量增加不明显，这表明手术可刺激大鼠外周血中晚期阶段的EPCs数量增加。另外，虽然在本研究中，随着荷瘤时间的延长，VEGF含量明显增加(P0.01)，但手术后，三组的VEGF含量差别不大，这提示手术动员EPCs可能与VEGF无关。手术切除术是治疗实体瘤的主要手段，而残余的肿瘤细胞是肿瘤复发的重要因素[15]。鉴于EPC在出生后血管形成中的重要作用，实体瘤的生长又强烈依赖于新血管形成，而手术能动员EPCs入血，那么，手术动员的EPCs是否参与肿瘤生长?本文观察了手术后肿瘤大小，结果发现与对照组相比，小手术组和大手术组的肿瘤体积没有明显变化。结果的可能原因之一是，手术会造成创伤，从而导致血管受损。手术动员来的晚期阶段的EPCs在早期可能主要用于伤口的修复，而不是发挥参与肿瘤血管新生的作用，从而促进肿瘤的生长。另一个可能原因是因为观察时间过短，尚不能看到EPCs参与肿瘤血管新生的作用。综上所述，手术能动员荷瘤大鼠的EPCs入血，但不影响VEGF水平，未观察到动员的EPCs与肿瘤生长的相关性。在以后进一步的研究中，需要延长手术后的观察时间，同时需扩大样本，进一步研究手术动员的EPCs对肿瘤生长的影响及其机制。

　　【参考文献】

　　1CReal，LRemédio，FCaiado，etal.BoneMarrow-DerivedEndothelialProgenitorsExpressingDelta-Like4(Dll4)RegulateTumorAngiogenesis.PloSone，2011,4(e18323.doi:10.1371/journal.pone.0018323).

　　2DudaDG，CohenKS，KozinSV，etal.Evidenceforincorporationofbonemarrow-derivedendothelialcellsintoperfusedbloodvesselsintumors.Blood,2006,107:2774-2776.

　　3VajkoczyP，BlumS，LamparterM，etal.Multistepnatureofmicrovascularrecruitmentofexvivo-expandedembryonicendothelialprogenitorcellsduringtumorangiogenesis.JExpMed,2003,197:1755-1765.

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