四川医学杂志投稿HPLC―DAD―ELSD同时测定知母中黄酮和皂苷类成
发布时间：2015-02-03 14:36所属分类：临床医学论文浏览：1次加入收藏
[摘要]建立HPLC-DAD-ELSD同时测定知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ 5个黄酮及皂苷类成分含量的方法。采用Merck Purospher STAR色谱柱(4.6 mm250 mm，5 m);流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脱;流速1.0 mLmin-1;柱温35
[摘要]建立HPLC-DAD-ELSD同时测定知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ 5个黄酮及皂苷类成分含量的方法。采用Merck Purospher STAR色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脱;流速1.0 mL・min-1;柱温35 ℃;检测波长为254 nm;ELSD检测器雾化气流速2.0 L・min-1;漂移管温度105 ℃;进样量10 μL。该条件下5个成分的分离度良好，标准曲线在检测范围内呈良好线性。加样回收率平均值为102.0%～104.0%，RSD为0.53%～1.8%。该方法快速、准确、重复性好，为知母药材的全面质量控制奠定了基础。
[关键词]四川医学杂志,知母,HPLC-DAD-ELSD,黄酮,皂苷,含量测定
Simultaneous determination of flavones and saponins of
Rhizoma Anemarrhenae by HPLC-DAD-ELSD
SU Xiao-nan1， JI De 1，2*， ZHOU Ya-ping1， WANG Li-jun1， ZANG Wen-yi1， MAO Chun-qin1， LU Tu-lin1，2*
(1. College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China;
2.Key Research Laboratory of Chinese Medicine Processing of Jiangsu Province， Nanjing 210023， China)
[Abstract]This study is to establish an HPLC-DAD-ELSD method for simultaneous determination of 5 flavones and saponins in Rhizoma Anemarrhenae including neo-mangiferin， mangiferin， timosaponin BⅡ， timosaponin BⅢ and timosaponin AⅢ. Samples were analyzed on a Merck Purospher STAR column(4.6 mm×250 mm， 5 μm). The mobiles phase consisted of acetonitrile(A) and 0.1% formic acid(B) with gradient elution at a flow rate of 1.0 mL・min-1 . The column temperature was set at 40 ℃. The DAD detector wavelength was set at 254 nm. The ELSD conditions were as follows： the nebulizing gas flow rate was 2.0 L・min-1 and temperature of drift tube was 105 ℃.The volume was 10 μL. The five compounds were well separated with good linear correlations. The mean recoveries were between 102.0%-104.0%. This method was quick and reliable which provides a foundation for quality control of R. Anemarrhenae.
[Key words]Rhizoma Anemarrhenae; HPLC-DAD-ELSD; flavones; saponins; content determination
doi：10.4268/cjcmm20150121
知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎。苦、甘、寒。归肺、胃、肾经。清热泻火，滋阴润燥。用于外感热病，高热烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘[1]。主产于河北，山西，陕西，内蒙古，黑龙江等地。知母化学成分主要有皂苷类、黄酮类、木脂素类及多糖类等，其中皂苷类及黄酮类是知母主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血糖及改善老年痴呆等作用[2]。目前有关知母药材的质量控制方法，文献报道主要有采用HPLC测定知母中芒果苷类成分的含量[3-4]，采用HPLC-ELSD测定知母皂苷类成分的含量 [5-6]或者采用HPLC-MS同时测定知母中甾体皂苷类成分的含量[7]，多针对其中一类成分进行分析。本实验采用HPLC-DAD-ELSD串联同时测定知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ 5个黄酮及皂苷类成分的含量，为知母的全面质量控制提供了一种快速简便的方法。 1材料
Waters 2695-2996 高效液相色谱仪(在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器;美国Waters公司)、Empower色谱数据工作站(美国Waters公司);Alltech 2000型蒸发光散射检测器(美国奥泰公司);空气泵公司;Millipore-Q超纯水制备仪(法国密理博公司);FA1104型电子分析天平(1/1万，上海精密科学仪器有限公司);MS105DU型电子分析天平(1/10万，梅特勒-托利多公司)。
芒果苷(批号111607-200301)、知母皂苷BⅡ(批号111839-201303)均购自中国食品药品检定研究院。新芒果苷、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度≥98%。色谱纯乙腈为Merck公司产品，Millipore-Q超纯水，其他试剂为分析纯。
知母药材收集于河北、安徽、山西等主产地，经南京中医药大学陆兔林教授鉴定为百合科植物知母的干燥根茎。标本保存于南京中医药大学药学院。药材粉碎后过50目筛，备用。
2方法与结果
2.1色谱条件及系统适应性实验Merck Purospher STAR色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.1 %甲酸水溶液(B)，线性梯度洗脱程序：0～7 min，10%～35% A;7～12 min，35%～100%A;12～15 min，100% A;15～17 min，100%～10%A。柱温35 ℃;流速1.0 mL・min-1。DAD检测器波长254 nm;ELSD检测器漂移管温度105 ℃，载气流速2.0 L ・ min-1。进样量10 μL。
在上述色谱条件下进行分析，新芒果苷保留时间为5.1 min、芒果苷保留时间为6.4 min、知母皂苷BⅡ保留时间为9.8 min、知母皂苷BⅢ保留时间为11.2 min、知母皂苷AⅢ保留时间为14.7 min，5个成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，色谱图见图1。
2.2对照品溶液的制备精密称取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加70%乙腈溶解并定容，分别配置成质量浓度为0.800 g・L-1新芒果苷，1.984 g・L-1芒果苷，0.818 g・L-1知母皂苷BⅡ，1.545 g・L-1知母皂苷BⅢ，1.034 g・L-1知母皂苷AⅢ对照品储备液。分别精密吸取上述储备液适量，置10 mL量瓶，70%乙腈定容，配制成新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ质量浓度分别为0.080 00，0.198 4，0.409 0，0.154 5，0.103 4 g・L-1的混合对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备取药材粉末(过50目筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %乙醇50 mL，称定质量，超声处理(功率100 W，频率40 kHz)30 min，取出放至室温，再称定质量，用70 %乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。
2.4线性关系考察精密吸取2.2项下的混合对照品溶液1，2，5，10，15，20，30 μL，注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定峰面积，对于新芒果苷、芒果苷以峰面积(Y)对分析物进样质量(X)作线性回归，对于知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ，以峰面积的对数值对分析物进样质量的对数值作线性回归，结果见表1。
2.5精密度实验精密吸取供试品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件进样检测，连续进样6次，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ峰面积的RSD分别为0.8%， 0.4%， 0.5%， 0.8%， 1.3%，表明仪器精密度良好。
2.6稳定性实验取同一供试品溶液10 μL，分别于0，1，2，4，12，24 h，按2.1项下色谱条件进样分析，测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ的峰面积，RSD分别为1.5%， 0.8%， 1.6%， 0.9%， 1.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7重复性实验取6份同一批知母粉末(产地：内蒙古，50目筛)约0.5 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，在2.1项色谱条件下进样检测分析，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ的RSD分别为2.4%， 0.3%， 0.9%， 1.3%， 2.7%，结果表明该方法的重复性良好。
2.8准确度试验取已知含量的知母粉末(产地：内蒙古，50目筛)约0.25 g，精密称定，共9份。根据样品中各成分含量的80%， 100%， 120%，分别加入新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ对照品各3份，按2.3方法制备成供试品溶液，进行HPLC分析，计算回收率。结果新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ的平均加样回收率分别为102.2%， 102.0%， 104.0%， 103.4%， 102.4%，RSD值分别为0.72%， 1.7%， 0.53%， 0.70%， 1.8%。
2.9样品含量测定分别取9批知母药材粉末约0.5 g，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，记录峰面积，每批次平行测定3次。外标法分别计算新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ的含量，结果见表2。 3 讨论
3.1样品前处理方法优化本实验对样品提取溶剂(50%，70%，95%乙醇， 30%丙酮)、提取方式(超声、回流法)、提取时间(0.5，1，2 h)分别进行了考察，最终确定以70%乙醇的超声提取0.5 h作为样品提取条件。
3.2流动相的选择分别考察了乙腈-水、乙腈-(0.1%)甲酸水溶液两种流动相系统，以乙腈-(0.1%)甲酸水溶液为流动相时峰形较好。对乙腈-(0.1%)甲酸溶液流动相系统经过多次考察优化，最终得到上述梯度洗脱程序，在此条件下各成分达到理想分离效果。
3.3检测器的选择及条件优化知母中所含的黄酮类成分芒果苷和新芒果苷含有发色团，具有较好的紫外吸收，适用于紫外检测器。而皂苷类成分为甾体皂苷类，分子中没有共轭结构，无紫外特征吸收，因此需采用蒸发光散射检测器(ELSD)检测。雾化气流速及漂移管温度是ELSD检测过程中较为重要的2个参数，对物质的响应值有较为重要的影响。分别考察了雾化气流速(1.8 ， 2.0 ， 2.2 L・min-1)和漂移管温度(95，105，120 ℃)，结果确定雾化气流速2.0 L・min-1，漂移管温度105℃时，基线平稳，检测效果较好。
3.4测定结果分析本实验共测定了7个产地共9批次样品，从测定结果来看，8个批次芒果苷的含量均大于新芒果苷，另有一批样品新芒果苷的含量大于芒果苷的含量，这可能与药材采收的季节有关[8]。各个批次样品中知母皂苷BⅡ的质量分数比较稳定，在4.11%～6.61%，是所测成分中整体含量最高的;知母皂苷BⅢ和知母皂苷AⅢ的质量分数分别在0.20%～2.75%，0.20%～4.41%，波动范围较大，这可能与知母的生长方式，生长年限，土壤状况以及采收时间有一定的关系。
总之，本实验所建立的HPLC-DAD-ELSD同时测定知母药材中芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷AⅢ 2类5个成分含量的方法，快速、准确，为知母药材全面质量控制奠定了基础。
[参考文献]
[1]中国药典.一部[S]. 2010： 197.
[2]王颖异，郭宝林，张立军. 知母化学成分的药理研究进展[J]. 科技导报，2010，28(12)： 110.
[3]梁雷，边宝林，王宏洁. 不同产地知母药材中芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量测定[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16(16)：49.
[4]罗洁，石绍淮，张靓琦，等. 超高效液相色谱法同时测定知母中芒果苷等6种成分的含量[J]. 中国药学杂志， 2012，47(22)：1856.