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发布时间：2015-02-03 14:32所属分类：临床医学论文浏览：1次加入收藏
[摘要]研究金丝桃苷(hyperoside，Hyp)预处理对抗大鼠心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的保护作用及其与PI3K/Akt信号通路的关系。通过可逆性左冠状动脉前降支结扎法建立心肌缺血再灌注模型，给予大鼠心肌缺血30 min，复灌12
[摘要]研究金丝桃苷(hyperoside，Hyp)预处理对抗大鼠心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的保护作用及其与PI3K/Akt信号通路的关系。通过可逆性左冠状动脉前降支结扎法建立心肌缺血再灌注模型，给予大鼠心肌缺血30 min，复灌120 min。健康雄性SD大鼠60只，随机分为5组：假手术组(Sham组)、缺血再灌组(MIRI组)、Hyp预处理组(Hyp组)、Hyp预处理联合PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002组(Hyp+LY组)及PI3K/Akt抑制剂组(LY组)。记录各组大鼠心脏血流动力学指标，测算心肌梗死面积和大鼠血清中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及白介素-6(IL-6)活性。Western blot法检测心肌p-Akt，Akt，Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果显示，与MIRI组比较，Hyp组大鼠心脏血流动力学指标明显改善，心肌梗死面积显著降低;血清中MDA含量和CK，CK-MB，TNF-α，IL-6活性降低，SOD，CAT和GSH-Px活性明显增强;p-Akt的蛋白表达和Akt磷酸化水平明显增强，且Bcl-2蛋白表达增强，Bax蛋白表达减弱(P<0.01)。而LY294002可显著取消Hyp的以上作用(P<0.01)。结果表明，Hyp对抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制可能与其激活PI3K/Akt 信号通路，上调Bcl-2 蛋白表达，下调Bax 蛋白表达等作用有关。
[关键词]发表论文期刊网投稿,心肌缺血再灌注损伤,金丝桃苷,预处理,PI3K/Akt信号通路
Protective effect against myocardial ischemia reperfusion injuries induced by
hyperoside preconditioning and its relationship with
PI3K/Akt signaling pathway in rats
HAN Jun1*， XUAN Jia-li1， HU Hao-ran1， CHEN Zhi-wu2
(1.Department of Pharmacology， Third-Grade Pharmacology Laboratory of State， Administration of
Traditional Chinese Medicine， Wannan Medical College， Wuhu 241002， China;
2. School of Basic Medicine， Anhui Medical University， Hefei 230031， China)
[Abstract]To investigate the protective effect of preconditioning with hyperoside (Hyp) against myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI) in rats and the role of PI3K/Akt signaling pathway. MIRI was established by ligation of left anterior descending coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 120 min in rats.Male SD rats were randomly divided into five groups： sham group，model group (MIRI)，Hyp preconditioning group(Hyp)，Hyp preconditioning+LY294002(a PI3K/Akt signaling pathway inhibitor) group(Hyp+LY)， and LY294002 group (LY). At the end of reperfusion， hemodynamic parameters were recorded as left ventricular systolic pressure (LVSP)， left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) and maximal rate of increase and decrease of left ventricular pressure (±dP/dtmax). Myocardial infarct size， the oxidative stress markers， myocardial enzymes indicators and inflammatory factors were also analyzed. The expressions of Akt， p-Akt， Bax and Bcl-2 proteins was detected by using Western blot method. The results showed that Hyp preconditioning remarkably improved cardiac constriction and relaxation function， reduced myocardial infarct size and enhanced the activities of oxidative stress markers about correlated to MIRI， such as superoxide dismutase (SOD)， catalase (CAT) and glutathione-peroxidase (GSH-Px)， and decreased the contents of malondialdehyde (MDA) as compared with MIRI group. Simultaneouly， the levels of myocardial enzymes， i.e. creatine kinase (CK) and creatine kinase MB isoenzyme (CK-MB)， and inflammatory factors， for instance tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were decreased. Hyp pretreatment apparently restrained myocardial apoptosis as evidenced by decreasing the level of Bax expression， increasing the levels of phosphorylation of Akt and Bcl-2 expression. These effects were inhibited by LY294002， a blocker of PI3K/Akt signaling pathway. These findings indicated that the cardioprotection of Hyp preconditioning against MIRI may be related to activating PI3K/Akt signaling pathway， upregulating the expression of Bcl-2 protein and down-regulating the expression of Bax protein. [Key words]myocardial ischemia reperfusion injury; hyperoside; preconditioning; PI3K/Akt signaling pathway
doi：10.4268/cjcmm20150123
心肌缺血性损伤在临床上较为常见，主要是心脏供血减少，导致心肌细胞缺血缺氧，影响心脏正常的能量代谢，从而出现心绞痛、心律失常等临床病症。深入研究心肌缺血再灌注损伤病理机制，探索保护心肌的新靶点及药物是目前医药界的热点。
金丝桃苷(hyperoside， Hyp)属于自然界中黄酮醇苷类化合物，其结构为槲皮素-3-半乳糖苷，研究表明，Hyp具有保护心肌作用，其机制可能与其抗脂质过氧化、抑制自由基的生成和钙超载，进而抑制心肌细胞凋亡的发生有关[1]。但其对抗心肌缺血损伤深入的机制尚不清楚，未见相关文献报道。本研究在心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)模型上，深入探寻Hyp预处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤作用与PI3K/Akt信号通路的关系，为今后Hyp用于临床治疗心肌缺血性损伤提供实验依据及新的治疗策略。
1材料
1.1药物与试剂Hyp(质量分数≥98.0%，批号111521-200303)由南京郎泽农业科技发展有限公司提供，使用前运用二甲亚砜(DMSO)将其溶解;LY294002(规格：5 mg，批号039K4625，使用前用DMSO将其溶解至质量浓度为0.3 g・L-1)购自美国Sigma公司;水合氯醛(chloral hydrate，批号060331)购自上海市白鹤化工厂有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)均购自南京建成生物工程研究所;兔抗Bcl-2多克隆抗体与兔抗Bax多克隆抗体购自 Santa Cruz公司;BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒、化学发光检测试剂盒购自中国沈阳碧云天生物技术公司;硝酸纤维素膜购自美国Bio-Rad公司。
1.2仪器HX-100E小动物呼吸机(芜湖市一帆医疗器械商行);BL-420S生物机能实验系统(合肥远明科技有限公司);Medlab生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司);UV-3200PCS紫外-可见分光光度计(合肥市科隆商贸有限责任公司);TGL16M高速冷冻离心机(合肥远明科技有限公司);FA 25匀浆机(合肥远明科技有限公司);Bio-Pro 200E凝胶成像系统(合肥远明科技有限公司)。
1.3动物健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重250～350 g，购自苏州大学实验动物中心，生产许可证号SCXK (苏)2009-0002。大鼠每6只1笼进行饲养，动物可自由饮水摄食，实验室饲养温度为(22±2) ℃，湿度55%～70%，实验前动物禁食12 h，不禁水。
2方法
2.1心肌缺血再灌注损伤模型建立[2]大鼠用10%水合氯醛(330 mg・kg-1)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪毛消毒后切开颈部，分离出右颈总动脉备用;暴露、切开气管，置气管套管接小动物呼吸机正压通气(呼吸频率60～70次/min)，四肢皮下插入电极，连接BL-420S生物机能实验系统，持续记录Ⅱ导联心电图。在胸骨左缘纵向切开皮肤，于第4，5 肋间逐层打开胸腔，剪破心包，充分暴露心脏，用5-0无损伤真丝线在左心耳下2 mm处穿过心脏表层(深度约1.5 mm)，用橡皮筋垫底，结扎左冠状动脉前降支致心肌缺血30 min，然后松开结扎线再灌注2 h。MIRI造模成功的标志：缺血时局部心肌组织苍白或发绀，心电图ST段抬高或T 波高耸;再灌注时缺血区心肌组织转红，明显抬高的ST 段降低50%以上。
2.2实验分组与给药大鼠40只，随机分成5组：①假手术组(Sham)：开胸，只穿线不结扎左冠状动脉前降支，持续150 min;②模型组(MIRI)：结扎左冠状动脉前降支缺血30 min后，松开结扎线再灌注120 min;③金丝桃苷预处理组(Hyp)：缺血前30 min，腹腔注射(ip)给药Hyp(50 mg・kg-1)[1]，缺血30 min，再灌注120 min，Sham和MIRI组ip等剂量的生理盐水;④Hyp联合LY294002组(Hyp+LY)：Hyp预处理前5 min，ip PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(0.3 mg・kg-1)[3]，缺血前30 min Hyp预处理，缺血30 min，再灌注120 min;⑤LY294002预处理组(LY)：缺血前35 min，ip LY294002，缺血30 min，再灌注120 min。
2.3血流动力学检测清除颈部淋巴结后分离出右颈总动脉，将PE50聚乙烯动脉导管经右颈总动脉插入至左心室，固定后用生理记录仪记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压上升的最大速率(+dp/dtmax)及下降的最大速率(-dp/dtmax)。
2.4心肌梗死面积测定参照文献方法[4]，在梗死区中心处，从心尖到心基部平行于房室沟方向将心脏切开，左心室被切碎，在1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中被温孵15 min(1×PBS，pH 7.4，37 ℃)。TTC染色后，梗死区心肌呈现苍白色，而活性心肌呈现红色。用手术刀片将未染色的非缺血区与红染的缺血坏死区分离，红染心肌的梗死体积被放入预先去皮盛有缓冲液的器皿中测量。心肌梗死面积以梗死区与总左室体积的比值来表示。 2.5生化指标检测各组大鼠均于再灌注120 min后，腹主动脉取血(约4 mL)，离心 15 min(3 000 r・min-1，4 ℃)，取上清放入-20 ℃ 冰箱冻存备用。测定血清MDA，SOD，CK，CK-MB，CAT，GSH-Px，TNF-α，IL-6等生化指标，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。
2.6Western blot法检测心肌p-Akt，Akt，Bcl-2和Bax的蛋白表达在心肌缺血再灌注末期，取大鼠左心室结扎线以下约 200 mg组织，在含有50 mmol・L-1 Tris-HCl(pH 7.4)，150 mmol・L-1NaCl，5 mmol・L-1 EDTA，1 mmol・L-1二硫苏糖醇，1%Triton X-100和1%蛋白酶抑制剂的裂解液中进行匀浆。将匀浆物离心15 min(12 000×g，4 ℃)，取上清液。蛋白质浓度测定采用BCA蛋白定量试剂盒。取50 μg蛋白样品，进行15% SDS-PAGE(10%分离胶，5%浓缩胶)电泳分离，湿转80 min后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，p-Akt抗体，Akt，Bcl-2和Bax抗体4 ℃孵育过夜，TBST 3×10 min 洗膜后加二抗(室温孵育2 h)，用化学发光检测试剂盒检测，鼠β-actin为内参对照，采用Image-pro Plus处理软件分析图像信息。
2.7数据统计方法结果采用SPSS 19.0统计软件进行分析，所有实验数据计数资料均以±s表示，2组比较采用非配对t检验，多组比较采用单因素方差(ANOVA)分析，P<0.05为差异有统计学意义。
3结果
3.1Hyp对大鼠心肌缺血再灌注后心脏血流动力学和梗死面积的影响与假手术组比较，模型组大鼠左室收缩压(LVSP)、左室内压上升的最大速率(+dp/dtmax)和下降的最大速率(-dp/dtmax)明显降低，而左室舒张末压(LVEDP)则明显升高(P<0.01)。用药金丝桃苷(Hyp)后，大鼠LVSP，+dp/dtmax，-dp/dtmax显著升高，LVEDP、心肌梗死面积则显著降低，与模型组比较，差异有明显统计学意义(P<0.01)。加入PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002后，与Hyp组相比较，LVSP，±dp/dtmax明显降低，LVEDP、心肌梗死面积明显升高，差异显著(P<0.01)，而与模型组比较，以上各指标无明显变化，提示PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002能取消金丝桃苷此作用，见表1。
3.2Hyp对大鼠心肌缺血再灌注后MDA，SOD，CK，CK-MB，GSH-Px，CAT，TNF-α和IL-6等指标的影响模型组大鼠MDA含量和CK，CK-MB，TNF-α，IL-6等活性显著升高，SOD，CAT和GSH-Px活性明显降低，与假手术组比较差异显著(P<0.01)。与模型组比较，Hyp组MDA含量和CK，CK-MB，TNF-α，IL-6活性降低，而SOD，CAT和GSH-Px活性增强，差异有显著统计学意义(P<0.01)。与Hyp组相比较，Hyp联用LY294002组及单用LY294002组SOD，CAT和GSH-PX活性明显减弱，MDA含量及CK，CK-MB，TNF-α和IL-6活性显著增强(P<0.05，P<0.01)。加入LY294002后，与模型组相比较，各组生化指标差异无显著意义，提示PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002抑制了金丝桃苷对以上各指标的作用，见表2，3。
3.3Hyp对大鼠心肌缺血再灌注后Akt磷酸化水平的影响各组大鼠Akt蛋白表达无显著性变化。心肌缺血再灌注后，p-Akt蛋白表达明显增强，Akt磷酸化水平(p-Akt/Akt)显著提高(与假手术组比较P<0.01)。用药金丝桃苷后，与模型组比较，Hyp显著提高了p-Akt的蛋白表达和Akt磷酸化水平(P<0.01)。而联用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002后，后者明显取消了Hyp增强p-Akt蛋白表达和Akt磷酸化水平的作用(P<0.01)，见图1。结果提示，Hyp对抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能与其激活PI3K/Akt信号通路有关。
3.4Hyp对大鼠心肌缺血再灌注后Bcl-2和Bax蛋白表达的影响与假手术组比较，心肌缺血再灌注组大鼠Bcl-2蛋白表达明显减弱(P<0.01)，而Bax蛋白表达显著增强(P<0.01)，Bcl-2/Bax明显减小(P<0.01)。与心肌缺血再灌注组比较，Hyp显著提高了大鼠Bcl-2的蛋白表达，减弱了Bax的蛋白表达，增大了Bcl-2/Bax。而Hyp联用LY294002组，大鼠Bcl-2的蛋白表达明显降低，Bax的蛋白表达明显增强，Bcl-2/Bax减小。表明LY294002显著抑制了Hyp增强Bcl-2表达和减弱Bax表达的作用，见图2。提示Hyp对心肌缺血再灌大鼠具有抗心肌凋亡作用，且与其激活PI3K/Akt信号通路有关。
4讨论
研究表明，正常细胞内存在一些激酶信号系统，如磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路，两者共同组成再灌注损伤挽救激酶通路(RISK)，其激活可明显减少MIRI。文献显示，发生再灌注时，预适应与后适应都可激活RISK 途径，并且两者可能具有相同的保护机制[5]。PI3K/Akt信号通路广泛存在于细胞中，是细胞内重要的信号转导通路，参与细胞激活、葡萄糖转运、蛋白质合成等调控，PI3K下游有众多效应分子，而Akt作为此通路的中心环节，其激活可作用于下游的B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)家族、核转录因子-κB(NF-κB)、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、天冬氨酸蛋白酶9(caspase-9)等多个靶点，并通过减少线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放，调控线粒体能量的生成，产生清除细胞内活性氧、抑制细胞凋亡、减少中性粒细胞的活化与聚集等后续反应，在对抗MIRI中发挥着重要作用[6]。 心肌发生缺血再灌注损伤时，缺血区心肌会产生能量代谢紊乱、收缩蛋白降解等病理性改变，导致心肌细胞出现功能异常，心室肌收缩与舒张功能发生障碍等。LVSP，LVEDP，±dp/dtmax反映左心室的收缩和舒张功能。在本实验中，课题组发现模型组大鼠左心室的收缩与舒张功能发生明显障碍。而加入Hyp后，LVSP，±dp/dtmax显著升高，而LVEDP、心肌梗死面积显著降低，表明Hyp能显著改善心肌缺血再灌时心室肌的收缩与舒张功能，且此作用能被PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002显著取消。
文献资料显示[7]，当心肌血供中断，能量供应减少，包括过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)等氧自由基清除酶系统功能会降低或丧失，导致氧自由基清除减少，生成增多。当恢复血供后，大量的氧自由基便会产生并过量堆积，从而又致脂质过氧化的产生。丙二醛(MDA)是氧自由基引发的脂质过氧化终末代谢产物，其活性反映氧自由基的脂质过氧化程度与含量。检测血清CAT，GSH-Px，SOD，MDA可直接反映机体内清除氧自由基的能力。另外，心肌缺血也会使线粒体、细胞膜受到损伤，导致膜通透性增加，肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等心肌酶释放至血液中，因此，心肌酶的活性也反映心肌细胞的损伤程度[8]。本实验中，课题组检测了MDA含量，CK，CK-MB水平及SOD，CAT，GSH-Px等活性的表达。结果显示，氧化应激参与了MIRI的病理过程，与文献报道结果一致[9]，而Hyp能有效清除氧自由基，减少心肌酶的释放，PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002能抑制其抗氧化的作用。炎症反应可进一步加重心肌缺血损伤，也是心肌缺血再灌的主要病理机制之一[10]。研究表明，当PI3K/Akt信号转导通路中Akt磷酸化减少，NF-κB、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等促炎症因子表达会增强，进而引起炎症反应，并可通过活化中心粒细胞诱导心肌细胞凋亡、促进氧自由基生成等加重MIRI[11]。本实验中，课题组发现Hyp能显著降低模型组大鼠血清中增高的TNF-α，IL-6活性，而LY294002能显著抑制Hyp减轻炎症反应的作用，提示Hyp可通过激活PI3K/Akt信号通路来清除氧自由基，减少心肌酶的释放，减轻炎症反应，产生对抗MIRI的保护作用。
MIRI还会导致心肌细胞凋亡，后者决定心功能的损伤程度。如何减少凋亡细胞数量，保护心肌细胞成为目前心血管研究领域特别关注的课题之一[12]。PI3K/Akt信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，在细胞增殖、代谢、凋亡等过程中发挥着关键作用。Bcl-2家族是 PI3K/Akt信号通路上的重要靶点，Bcl-2，Bax(Bcl-2 associated x)属于Bcl-2家族中的核心成员[13]，它们在细胞凋亡的发生与发展中起重要作用。Bcl-2是主要的凋亡抑制蛋白，可通过调控线粒体膜的完整性参与凋亡信号的调节，促进心肌细胞存活，抑制其凋亡。而Bax则相反，它与Bcl-2形成异源二聚体，抑制Bcl-2而促进细胞凋亡。当心肌缺血后，Bcl-2与Bax在心肌细胞都有表达，前者的过度表达能显著抑制MIRI后心肌细胞的凋亡，减少梗死面积。并且Bcl-2与Bax的平衡在细胞凋亡调控中发挥着重要作用，Bcl-2/Bax降低表明诱导细胞凋亡，比值升高则相反，抑制细胞凋亡。研究表明，Akt激活(p-Akt)可促进抗凋亡蛋白Bcl-2生成，抑制Bax，Bad及caspase等促凋亡蛋白的形成，也可使GSK-3β发生磷酸化而失去诱导细胞凋亡的能力，从而抑制细胞凋亡。本实验中，课题组发现与模型组比较，Hyp明显提高了p-Akt的蛋白表达和Akt磷酸化水平，上调抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，下调促凋亡蛋白Bax 表达(P<0.01)。而LY294002可取消Hyp的该作用。提示，Hyp抑制大鼠心肌细胞的凋亡，对抗MIRI的保护作用可能与其激活PI3K/Akt信号通路有关。
综上所述，Hyp对抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制可能与其通过激活PI3K/Akt 信号通路，改善心室肌收缩与舒张功能，清除氧自由基，减少心肌酶释放，减轻炎症反应，上调Bcl-2 蛋白表达，下调Bax 蛋白表达，抑制细胞凋亡的发生等作用有关。但由于心肌MIRI的发生机制较为复杂，涉及多种信号通路的激活，如Hyp对ERK1/2信号通路是否存在影响等，还有待于进一步深入研究。
[参考文献]
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